林木基因組學的研究現狀和未來目標(一)

2022-09-23 09:47:18 Evolutionary Games 2022-09-23



背景

     森林是地球上的主要组成部分,在地球上进行空气净化、地下水补给和气候调节,并在全球能源、碳、水和养分循环中发挥着主导作用。森林对地球生态系统和人类生活至关重要。工业化时期以来,由于化石燃料燃烧等人类活动的增加,地球整体温度上升,气候变化大,这些变化严重威胁了森林。现在全球的人口还在不断增加,对林木资源的需求也会不断上升,保护林木免受砍伐和破坏的压力越来越大。        

      应对上述挑战的策略之一是提高林木生产力、适应力、恢复力和保证林木的可持续性发展,这需要采用多种方法,而林木基因组学发挥关键作用。由于多种高通量测序技术的出现,林木基因组学领域得到了快速发展。单细胞RNA测序、CRISPR介导的基因组编辑、空间转录组以及生物信息学分析技术,这些技术产生了大量的多维、多层和时空基因表达数据。它们再加上植物生物技术能够解决林木生物学中许多重要的问题,阐明表型变化变异背后的分子调控机制

    2022年8月31号,在Forestry Research发表了题为“Current status and trends in forest genomics”的综述,文章总结了12个林木基因组学的研究现状,并为每个领域提供了未来的研究方向和重点,能够帮助林木基因组学的发展,以提高森林生产力和可持续性,加快森林树木的驯化,应对气候变化,满足世界人口持续增长造成的对森林产品日益增长的需求。

01

 木材形成



     生物质能则是太阳能以化学能形式储存在生物质中的能量形式,它一直是人类赖以生存的重要能源之一,是仅次于煤炭、石油、天然气之后第四大能源,在整个能源系统中占有重要的地位。木质生物质或具有加厚次生细胞壁(SCW)的木质部细胞,由纤维素、半纤维素(木聚糖)和木质素组成。木材通过复杂但高度协调的调控过程形成,包括维管形成层细胞分裂以及木质部细胞分化。目前主要使用拟南芥、杨树、桉树等物种研究控制维管形成层发育和木质部细胞分化的分子网络。

     NAC家族(转录因子)成员的 N端具有一个保守的约150个氨基酸组成的NAC结构域。与维管相关NAC结构域(VND)亚家族蛋白VND6VND7分别被确定为中间木质部(即以凹坑或网状形式沉积的SCW)和原木部(即螺旋形SCW)分化的主调节因子,调节SCW形成基因和细胞程序性死亡(PCD)。MYB46和MYB83是在拟南芥中发现的SCW生物合成的主要调节因子,通过高度复杂的调节网络以前馈方式直接/间接调节下游转录因子和结合SCW生物合成基因。

    PtrHB7是杨树HD-ZIP III家族的成员,参与了生长素诱导的木质部分化调控网络。目前在维管形成层发育的分子机制理解方面取得了相当大的进展,研究揭示了转录因子和激素的协调调节机制对维管形成发育所至关重要。生长素和细胞分裂素(CK)在调节原形成层细胞的启动和维持中发挥关键作用。已知生长素信号IAA12-ARF5/MP模块控制拟南芥的原形成层的形成;最近发现一个类似的模块(PtoIAA9-PtoARF5)在生长素诱导的杨树木质部细胞分化中起作用。

     目前,对原形成层发育成维管形成层的潜在分子机制的理解仍然有限。PtrHB4被发现可以诱导杨树茎束间形成层细胞的分裂,因此,对位于PtHB4下游的靶基因的进一步分析有望为理解这一过程提供线索。关于木材未来的研究可能集中在形成层细胞特性的维持,以及形成层细胞向次生木质部和韧皮部的发育过程,通过scRNA-seq和基于空间转录组的技术结合,可以确定这些过程中细胞和组织特异性的新调节因子。

02

CRISPR技术是林木改良强有力的工具



     CRISPR介导的基因组编辑技术在林木基因工程、研究和理解其在气候变化期间的生长、恢复力和适应方面具有巨大潜力。杨树和桉树已经具有成熟的农杆菌遗传转化体系和丰富的基因组资源,但鉴于CRISPR介导的植物基因组编辑技术仍在不断扩展,使用未开发或新设计的CRISPR效应器对实验的特异性和效率有着很大的提高空间。已证明靶向插入或替换基因的方法可提高HDR(基于DNA双链断裂指导的同源修复)介导的精确修饰效率,如串联重复HDR和转录模板HDR。

未来可能在以下几个领域开展更多基于CRISPR 的研究:

①可以在功能缺失突变体中研究来自数量性状基因座(QTL)(它指的是控制数量性状的基因在基因组中的位置)和关联研究(它用来测试一个因子和结果的关系)的候选基因或来自其他植物物种的同源基因的生物学功能;

②即使在关联研究中影响很小,等位基因变体的功能也可以通过CRISPR系统中的精确敲除进行研究;

③通过同时插入或交换已知功能的基因的不同调控元件(即增强子和启动子),调节基因调控网络中基因的表达水平,以及微调生物合成的开关和限速酶,可以实现数量性状的改善。

④通过基于CRISPR技术的内源基因转录激活,可以获得具有更好抗病性和适应性的树木。

     最近,建立了新的精确DNA碱基颠换,使用与逆转录酶(RT)融合的nickase Cas9编辑工具可以介导缺失、插入、碱基转换的特定组合,以替换靶序列。RT由prime-editing guide RNA(pegRNA)引导,其由指定目标位点的扩展gRNA和包含期望编辑的RT模板序列组成。总的来说,CRISPR技术的稳定性使森林遗传学和林木育种领域的研究人员能够利用所有植物基因组进行探索研究。

03

单细胞RNA测序技术及其在林木基因组学的应用



     在器官形成过程中,细胞命运的决定和分化受到连续转录调控的精确控制。从形成层到次生木质部或次生韧皮部的细胞命运的确定仍然是难以捉摸的。由于现有的转录组分析(RNA-seq)只能获得整个组织的信息,因此难以区分和分析不同的细胞类型。随着单细胞的成功分离, scRNA-seq 已成为研究组织中单个细胞基因表达的有力工具。因为它可以根据细胞类型将细胞分类为不同的组,并量化细胞类型特异性表达,还可以进行细胞分化和发育的细胞轨迹分析。

     通过重建形成层和周围细胞之间的时空关系,有可能分别跟踪次生木质部和韧皮部的渐进细胞命运变化,并发现新的关键细胞类型特异性调节因子。

    目前在植物中的大多数研究使用原生质体进行 scRNA-seq ,这依赖于成功的原生质体制备。从位于器官内部组织且具有厚细胞壁的细胞中分离高质量原生质体是具有挑战性的,特别是在树木中。对于某些特定组织和大多数物种,需要提高原生质体制备效率。酶消化去除细胞壁从而导致的较长孵育时间可能会引起转录活性的某些变化,单核RNA测序(snRNA-seq)可以避免原生质体效应,在拟南芥、水稻和杨树中已经建立了snRNA-seq数据库。尽管观察到snRNA-seq比scRNA-seq捕获的每个细胞的基因表达更少,但仍值得将snRNA-seq扩展到其他组织,scRNA-seq数据可以与其他转录组数据整合,以探索关键调控因子和新机制。snRNA-seq和snATAC-seq的整合分析阐明了细胞类型特异性标记的染色质可及性,表明染色质可及性可以用作指示根毛和内胚层细胞发育状态的分子标记。

      scRNA-seq在突变体或转基因中的进一步广泛应用将增强对目标基因转录调控的理解。scRNA-seq缺乏空间信息,这个问题可以通过与空间转录组的组合来解决,不过这种组合在植物中目前还尚未报道。总的来说,越来越多的scRNA-seq研究在植物中进行,为器官形成过程中细胞状态的转录调控提供了见解。预计在不久的将来,染色质免疫沉淀(ChIP-seq)、DNA甲基化、单细胞水平的蛋白质-蛋白质相互作用,也将在植物中成功实现。

04

单倍体诱导和育种



     通过杂交产生杂种优势的自交系至少需要六代才能在大多数农作物中获得近似完全的纯合性。这可能需要更多的世代和更长的时间,因为它们的杂合度更高,幼年期长,世代周期长,以及自交不亲和性。因此,以常规方式在树木中实施近亲繁殖改进策略实际上是不可能的。获得单倍体植物可以克服以上困难,单倍体不仅可以提高基因组测序和组装的效率,还可以通过染色体加倍产生纯合物种。加倍单倍体(DH)系甚至优于自交系,因此在树木育种、基因组测序和组装以及其他基于基因组的研究中具有巨大价值。

     一些应用于培育单倍体农作物方法已被改良在林木中使用。,如利用胁迫处理的花粉进行异花授粉,刺激单性生殖诱导单倍体树木;花粉粒通常会受到物理胁迫的预处理,如高温、热、辐射或甲苯胺蓝等化学物质。据报道,未授粉子房可以发育成单倍体杨树,这表明被子植物的雌配子体和大孢子可以在体外诱导孢子体发育,从而为单倍体育种创造了新途径。花药或花粉培养与组织培养条件下的植物激素处理相结合是树种中最常用的方法。但是树木对组织培养和再生的抗性,在体外产生的单倍体树种要少得多,此外,由单倍体产生的DH树通常表现出较差的生命力,往往在达到开花年龄之前就很难存活。到目前为止,由于高纯合性导致的适应性差,尚未报告建立树木物种的DH种群。

     未来,应做出更多努力,提高诱导效率,建立有效方法,以便于获取大量DH系,并提高其在温室和田间条件下的存活率。

05

树木对遗传转化和再生的抵抗



     培育具有理想性状的转基因树的依赖于遗传转化技术和随后的再生。各种转化方案,包括农杆菌介导的转化、聚乙二醇(PEG)介导的直接转移和基因枪法已应用于植物。其中最广泛使用的是农杆菌介导的T-DNA转化,通常具有最高的转化效率,随后的再生是恢复转基因植物的必要过程。

     尽管遗传转化和再生已广泛应用于许多树种,但树木的遗传转化和再生仍主要应用于模式树木(杨树和桉树)和果树。最广泛的方法是选择最适合的基因型和组织,如幼叶、叶柄、子叶和植物激素(如生长素和细胞分裂素的使用)。

     但随着植物变老,发育和分化以及表观遗传修饰使植物激素反应性失活,从而导致不同程度的顽固性和不可再生性。一些控制转化适应性的基因已被鉴定,例如BBMWUSCHELSTMWOX,以及GRF-GIF合成基因,这些基因已被用于提高再生潜力。一般植物激素包括生长素、细胞分裂素和脱落酸,都能触发植物再生的信号,激活调节发育的基因,促进细胞命运的转变(去分化)和植物发育下游基因的表达,如GRF-GIF表达的嵌合蛋白具有清除植物再生的表观遗传调节障碍的能力。

然而,以下问题仍有待回答:

①控制植物再生的发育基因(包括BBM、WUSCHEL、STMWOX)的上游调节基因是什么?植物激素如何激活发育基因调节?

②什么因素导致衰老过程中植物激素反应性丧失,以及如何恢复这一过程?

③在体细胞胚胎发生过程中,决定胚胎发生能力的关键因素是什么?

④在体细胞胚胎发生过程中,外部信号(如应激和植物激素)是如何转导以启动这些因子的上调的?

⑤老化或继代培养如何影响外植体的胚胎发育能力?

     此外,基于组织培养的常规再生方案比较麻烦,特别是对具有更长世代的树木。一些科学家试图绕过再生过程,例如,在拟南芥和烟草中建立了无组织培养的转化系统。然而,这些新的方案还不能在整个转化过程中完全绕过组织培养,并且还没有应用于树木。现在也没有证据可以证实抗再生的分子机制,应继续开展工作,深入了解这一过程。这对树木的遗传转化和再生具有重要意义。

06

固氮:银合欢根瘤菌共生的特点



     豆科根瘤菌共生的最新知识来源于对田间豆科植物(如苜蓿、豌豆、豆类和大豆)结瘤和固氮的研究,以及模式豆科植物,如日本莲和截短苜蓿,通过它们与兼容根瘤菌的相互作用。关于豆科树木和根瘤菌之间固氮共生的知识相对较少。此外,一些树豆科植物具有不寻常的特征,例如,夏威夷群岛特有的豆科树木相思树(Acacia koa)与缓生根瘤菌共生,产生根结瘤和冠层结瘤。与特定快速生长根瘤菌有关的一种豆科树木银合欢在共生固氮上还有一个特点,银合欢可以产生一种有毒化合物含羞草碱,它存在于植物的所有部分,包括根和根瘤,含羞草素也通过根分泌物分泌到根际。根际或根瘤中的根瘤菌必须克服含羞草碱的毒性,结瘤银合欢的根瘤菌在根际和根瘤内可以降解含羞草素。

     含羞草碱通过形成Fe3+-含羞草素络合物螯合根际的Fe3+离子,从而剥夺这些根瘤菌的Fe3+,并降低其生长。另一方面,含羞草碱降解菌株,如TAL1145,可吸收Fe3+含羞草素络合物并将其用作碳和氮源。因此,它们可以在含羞草碱存在下生长,更有效地占据结节。银合欢根际自由生活根瘤菌降解含羞草碱的作用机理,图1。含羞草有助于银合欢对Fe的吸收,银合欢即使在碱性土壤中也能成功生长,其中铁形成不溶性氢氧化物,植物无法吸收。

     利用植物铁载体和寡肽转运蛋白的铁吸收系统在草本植物中很常见,被称为铁吸收策略II。银合欢还采用了铁吸收策略I,该策略涉及膜结合铁螯合还原酶将Fe3+转化为Fe2+,然后通过铁调节转运体(IRT)被植物吸收。银合欢根际的自由生活根瘤菌也可能吸收Fe3+-含羞草素复合物并降解含羞草碱,将Fe2+释放到根际,在根际,植物使用IRT转运蛋白吸收。未来的研究将应用基因组编辑技术开发新的银合欢品种,用于调控含羞草素生物合成基因的表达。

图1 含羞草碱和自由生活根瘤菌对银合欢铁吸收的作用


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